Tkáňové kultury
Tkáňové kultury reprezentují jeden ze stěžejních experimentálních přístupů současné medicíny. Jedná se o kultivaci částí tkání či jednotlivých buněčných linií v podmínkách in vitro, tedy v prostředí, kde můžeme pro kultivaci zajistit stabilní podmínky.
Velkým mezníkem v pěstování buněčných linií byl rok 1951, přesněji 8. únor tohoto roku, kdy byla získána první lidská buněčná linie - byla izolována z karcinomu děložního čípku od pacientky Henrietty Lacks, podle níž dostala i své jméno - HeLa. Dodnes se jedná o jednu z nejpoužívanějších buněčných linií.
Obrázek 1: Buňky kostní dřeně pěstované in vitro (skenovací elektronový mikroskop)
Ke kultivaci buněk v tkáňové kultuře je nezbytná speciálně vybavená laboratoř. Ta musí být pečlivě navržena a zařízena dobře omyvatelným vybavením a slouží výlučně jen pro laboratorní účely. Bývá vybavena filtrem proudícího vzduchu a UV lampou, která po skončení denních prací slouží k hubení mikroorganismů. Vzduch v laboratoři by měl za pomoci speciálních zařízení cirkulovat tak, aby celý jeho objem prošel světlem zářiče a došlo k jeho plnému očištění. Personál je povinen používat obuv a oděv určený výhradně pro práci v laboratoři.
Veškerá manipulace s tkáňovými kulturami probíhá ve speciálních přístrojích – laminárních boxech (sterilní box, flow box, obrázek 2). Toto zařízení výrazně snižuje, až znemožňuje kontaminaci buněk bakteriemi a jinými nežádoucími mikroorganismy. Laminární proudění v boxu udržuje vzduch v pohybu a filtruje ho tak, aby byl stále čistý. Přesto je při práci v boxu potřeba používat rukavice a pečlivě dezinfikovat všechny věci, které jsou do boxu vneseny. Před každým použitím se navíc používá UV lampa, která zneškodní i odolnější mikroorganismy. Jen dodržováním tohoto postupu se docílí čistého a bezpečného prostředí pro práci s buněčnými kulturami.
Obrázek 2: Laminární box
Druhým nepostradatelným přístrojem v laboratoři tkáňových kultur je tzv. inkubátor (obrázek 3). Toto zařízení zvenčí nikoli nepodobné lednici má za úkol udržovat uvnitř stále stejné prostředí tak, aby buňky, se kterými se právě nepracuje, mohly žít v prostředí co nejpodobnějším podmínkám původního organismu. Zásadním parametrem je teplota, optimální pro většinu buněk je kultivace při teplotě 36,5-37 °C. Dalšími důležitými parametry jsou vlhkost a zvýšené zastoupení CO2. Vlhkost se udržuje okolo 95%, aby se množství média v kultivační nádobě nezmenšovalo a zachovávalo relativně stálý objem. Tenze CO2 je udržována na 5%.
Ke sledování růstu buněk, jejich kolonií a kontrole, zda buněčná kultura není kontaminována jinými mikroorganismy, slouží tzv. invertovaný mikroskop. Od klasického mikroskopu se liší tím, že objektivy jsou uloženy ve spodní části mikroskopu a díky soustavě zrcadel je nám umožněno pozorovat buňky zespodu. Důvodem je, že většina buněk roste přisedle (adherentně) a díky pohledu zdola není nutné k jejich pozorování překonávat mnohdy značně vysokou masu kultivačního média.
Médium je roztok určený k výživě a ochraně buněk (obrázek 4). Poskytuje buňkám substrát potřebný k životu i růstu.
Většina současných médií obsahuje také fenolovou červeň, která je indikátorem pH. Výzkumník pracující s buňkami, díky ní snadno rozpozná změnu pH, která již může být pro buňky škodlivá. PH se mění vlivem metabolitů, které buňky vylučují do svého okolí. Vzhledem k absenci v organismu běžného odplavování zplodin krví, je potřeba médium často měnit, abychom alespoň částečně tento proces nahradili. Pokud se červeň média zbarví do fialova, znamená to, že se médium stává zásaditější, naopak zesvětlování média od červené (pH 7,4) přes oranžovou (pH 7,0) až do žluta (pH 6,5) značí pokles pH.
Složení nejčastěji používaných médií:
MEM – Minimal Essencial medium (Eaglovo medium); obsahuje vodu, esenciální aminokyseliny, vitamíny a soli.
DMEM – Dulbekova modifikace MEM; obsahuje dvakrát tolik aminokyselin jako MEM, čtyřikrát více vitamínů a dvakrát tolik CO2 a HCO3- pro lepší pufrovací výsledky.
Alfa MEM - má oproti MEM více aminokyselin a vitamínů, stejné množství nukleosidů a navíc obsahuje kyselinu lipoovou.
Obrázek 3: Inkubátor pro kultivaci tkáňových kultur
Obrázek 4: Média pro kultivaci tkáňových kultur
Většina buněčných kultur potřebuje ke své proliferaci kontakt s podkladem – rostou tedy tzv. adherentně a postupně pokryjí celé dno kultivační nádobky (kultivační lahve, Petriho misky (PM) či vícejamkové destičky – obrázek 5) – vytvoří tzv. monolayer. V tomto stádiu se již není možná jejich další proliferace a je nutné přistoupit k pasáži.
Pasážováním se rozumí přenesení pouze části buněčné populace z kultivační nádoby, kde již buňky dospěly do stádia monolayeru, do nové. Schéma pasážování je znázorněno na obrázku 6. Na obrázcích 7 a 8 je zachycen vzhled buněk ihned po pasáži a 24 hodin po ní, kdy již buňky opět rostou adherentně.
Obrázek 5: Kultivační nádobky – kultivační lahve, misky a destičky
Obrázek 6: Pasážování – adherentní buňky narostlé na Petriho misce (PM) do monolayeru jsou rozvolněny pomocí trypsinu. Po přidání média se sérem (k zastavení štěpící reakce) je suspenze buněk přenesena do zkumavky a centrifugována. Poté je odsáto médium a peletě buněk přidáno nové (bez obsahu trypsinu). Ze vzniklé suspenze je přenesena jen malá část na novou PM.
Obrázek 7: Buňky přenesené na novou kultivační misku ihned po pasáži
Obrázek 8: Buňky 24 hodin po pasáži – adherované k podkladu