Úvod > Diferenciační postupy

Kultivace

Základní nediferencované kmenové buňky (v našem případě embryonální nádorové kmenové buňky linie P19) jsou kultivovány na tkáňových kultivačních miskách, potažených 0,1% vodným roztokem želatiny, v Dulbecco`s modified Eagle`s médiu (DMEM), s obsahem 10% fetálního telecího séra, 0,1 mg/ml L – glutaminu, 0.05 mM β-merkaptoetanolu, 100 i.u./ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu.

Buňky jsou kultivovány v plastových miskách, lahvích nebo destičkách. Pokud buňky porostou celý povrch kultivační nádoby – vytvoří tzv. monolayer, musí dojít k pasáži (přenesení části buněk na jinou kultivační nádobu). Podrobněji se tomuto tématu věnuje první kapitola – Tkáňové kultury.

Neurodiferenciace

Jedním z aktuálních témat v medicíně je léčba neurodegenerativních onemocnění. Ztráta neuronů vede obvykle k funkčnímu deficitu a regenerace v centrálním nervovém systému (CNS) je omezená, ne však zcela nemožná. Léčba onemocnění CNS je sice problematická, ale nadějnou metodou vedoucí k náhradě postižených či zaniklých buněk a povzbuzení vnitřních regeneračních mechanismů v postižené tkáni by mohlo být právě využití kmenových buněk.

Neurodiferenciace myších kmenových buněk je provedena za pomoci roztoku retinové kyseliny (RA, c = 5 x10^-7 M) a výměny média kultivačního za diferenciační - bezsérové (SF), jedná se o médium DMEM/F12 (1:1), které je doplněno o 0,1 mg/ml L – glutaminu, 0,1 mg/ml selenu, insulinu a transferinu, 100 i.u./ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu.
Buňky jsou kultivovány v diferenciačním médiu s kyselinou retinovou po dva dny, od třetího den již přidáme pouze samotné diferenciační médium - DMEM/F12). Přibližně po jednom týdnu můžeme pozorovat vznikající neuronální fenotyp buněk, jak je viditelné z obrázku 1 (nediferencované buňky) a 2, 3,4 (diferencované buňky).

Obrázek 1 a 2: Nediferencované a diferencované (neuronální fenotyp) embryonálních nádorových kmenových buněk linie P19

Obrázek 3 a 4: Neuronální fenotyp diferencovaných embryonálních nádorových kmenových buněk linie P19

Kardiodiferenciace

Onemocnění kardiovaskulárního systému, zvláště pak infarkt myokardu, vévodí tabulkám morbidity a mortality v průmyslově vyspělých zemích. Infarkt myokardu může vést ke ztrátě kardiomyocytů a náhradě kontraktilní tkáně fibroblasty, čímž dochází k formování méněcenné vazivové jizvy, která postrádá kontraktilní vlastnosti a vede k regionální dysfunkci srdeční tkáně.

Jednou z možností léčby srdečních onemocnění v jejich konečné fázi je transplantace srdce. Tu ale doprovází jednak imunologické obtíže, nežádoucí účinky imunosupresivní léčby, pooperační komplikace a mnoho dalších limitujících faktorů. Jako alternativa orgánové transplantace připadá v úvahu transplantace buněčná, jejímž důsledkem by měla být jak reparace poškozených kardiomyocytů, a tedy podpora srdečních funkcí, tak také podpora tvorby cév (diferenciací podaných endotelových progenitorů). Při in vitro pokusech jsou jako jedna z možných variant studovány i embryonální kmenové buňky.

Nediferencované myší embryonální kmenové buňky linie R1 byly kultivovány na tkáňových kultivačních miskách potažených 0,1% vodným roztokem želatiny v Dulbecco`s modified Eagle`s médiu (DMEM). Toto médium bylo obohaceno o 20 % fetálního telecího séra, 0,1 mg/ml L – glutaminu, 0,05 mM β-mercaptoethanolu, 100 i.u./ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu a 1000 u/ml leukemického inhibičního faktoru (LIF), který zajišťuje udržení pluripotence.

Pro získání embryoidních tělísek (EB) byly buňky přeneseny do neadhezivních bakteriologických misek a jejich předchozí médium bylo vyměněno za jiné, které bylo svým složením shodné s předchozím, vyjma přítomnosti LIF. Poté došlo k formování embryoidních tělísek a k aktivaci diferenciačních pochodů (kultivované buňky a vzniklá EB jsou vidět na obrázku 1, 2 a 3). Buňky byly takto kultivovány po 6 dní. Vzniklá EB byla následně přenesena zpět na kultivační misky potažené prasečí želatinou a kultivována ve stejném médiu, tj. v médiu bez LIF. Po 24 hodinách bylo médium odsáto a nahrazeno médiem bezsérovým (SF), jedná se o médium DMEM/F12 (1:1), které je doplněno o 0,1 mg/ml L – glutaminu, 0,1 mg/ml L selenu, insulinu a transferinu, 100 i.u./ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu. V tomto médiu pak dochází ke konečné diferenciaci myších embryonálních kmenových buněk. Po 14-ti dnech bylo možno pozorovat kontraktilní aktivitu vznikajících kardiomyocytů (video). Imunocytochemický průkaz markeru kardiomyocytů – těžkého řetězce myosinu, je patrný z obrázku 4.